Сравнительная геномика дрожжей Saccharomyces - страница 2

Сравнительная геномика дрожжей Saccharomyces - страница 2

^ Материалы и методы исследования
Объекты исследования. В работе было изучено более 270 штаммов дрожжей Saccharomyces, изолированных в разных регионах мира из природных источников и ферментационных процессов. Происхождение основных штаммов можно найти на следующих сайтах коллекций в интернете: CBS, www.cbs.knaw.nl; ATCC, www.lgcstandards-atcc.org; NCYC, www.ncyc.co.uk; NRRL, nrrl.ncaur.usda.gov; NBRC, www.nbrc.nite.go.jp; UCD, www.phaffcollection.org и ВКМ, www.vkm.ru.

^ Методы исследования. Культивирование дрожжей, отбор ауксотрофных мутаций и получение моноспоровых клонов проводили согласно стандартным методикам (Захаров и др., 1984; Guthrie, Fink, 1991). Выделение двунитевой РНК (днРНК) проводили по методу Fride и Fink (1978), с некоторыми модификациями. Киллерную активность штаммов дрожжей определяли согласно методике, описанной ранее (Наумов, Наумова, 1973). Анализ полиморфизма длин рестриктазных фрагментов (ПДРФ-анализ), клонирование и секвенирование ПЦР-продуктов проводили стандартными методами (Sambrook et al., 1989).

Приготовление препаратов хромосомных ДНК и их электрофоретическое разделение на аппарате CHEF-DR III фирмы “Bio-Rad” (США) проводили согласно Naumov et al. (1990). Перенос хромосомных ДНК на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли капиллярным способом. Для мечения ДНК применяли нерадиоактивную метку с использованием UTP, меченного дигоксигенином (dig-II-dUTP) из набора “DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I” (“Roche”, Германия). Гибридизацию и проявление гибридизационных сигналов также проводили по инструкции фирмы-изготовителя (“Roche,” Германия). Филогенетический анализ исследуемых нуклеотидных последовательностей проводили с помощью алгоритмов Neighbour-Joining и UPGMA из пакетов компьютерных программ MEGA3 (Kumar et al., 2004) и TREECON (van der Peer, de Wachter, 1994). Индексы бутстрепа, определяющие статистическую достоверность выделения групп, подсчитывали для 1000 псевдореплик.

Для опытов по ДНК-ДНК реассоциации ДНК очищали методом хроматографии на гидроксилаппатитных колонках (Britten et al., 1970). Степень гомологии ДНК оценивали спектрофотометрическим методом путем определения кинетики ДНК-ДНК реассоциации, как описано Seidler и Mandel (1971) и модифицировано Kurtzman et al. (1980). Использовали спектрофотометр Gilford Response II и его программу термальной кинетики.

Выделение геномной ДНК для сравнительной геномной гибридизации на микрочипах проводили с использованием набора “Promega” Genomic DNA Purification Kit согласно протоколу фирмы изготовителя (Promega Corporation, США). Очищенную фрагментированную ДНК метили флуоресцентными красителями (зеленый цианин 3 (Cy3) и красный цианин 5 (Cy5)) с помощью метода рассеянной затравки (Maniatis et al., 1982). Для гибридизации использовали ДНК-микроматрицы разных типов: 1 - стеклянные ДНК-биочипы с ПЦР-продуктами, соответствующими каждой открытой рамке считывания секвенированного штамма дрожжей S. cerevisiae S288с (Hayes et al., 2002); 2 - олигонуклеотидные микрочипы высокой плотности фирмы Affymetrix (Affymetrix Gene Chip, США); 3 – микрочипы фирмы CombiMatrix с 3352 генами секвенированного генома S. bayanus и S. cerevisiae. Дизайн и печать этого микрочипа были осуществлены нами совместно с научной группой Манчестерского биоинформационного центра.

Нормализацию полученных данных сравнительной гибридизации на стеклянных биочипах и микрочипах фирмы Affymetrix проводили с помощью программы RMAExpress (http://rmaexpress.bmbolstad.com). Графическое изображение нормализованных данных для каждого анализируемого штамма было получено с помощью программы CGH Miner (http://www-stat.stanford.edu/~wp57/CGH-Miner). Результаты гибридизаций на биочипах CombiMatrix обрабатывали с помощью программ Microarray Imager (www.combimatrix.com) и CGH Miner (http://www-stat.stanford.edu/~wp57/CGH-Miner).

^ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

  1. Сравнительный анализ геномов дрожжей Saccharomyces: биологический вид S. cariocanus

Штаммы североамериканской популяции дрожжей S. paradoxus по некоторым молекулярным маркерам не отличаются от дрожжей биологического вида S. cariocanus и на этом основании было высказано предположение о конспецифичности указанных видов (Liti et al., 2005, 2006). Для выяснения таксономического статуса дрожжей S. cariocanus мы провели их детальное молекулярно-генетическое изучение с помощью ДНК-ДНК реассоциации, молекулярного кариотипирования, секвенирования генов рРНК и митохондриального гена ATP9.



*

*

*


Рисунок 1. Значения гомологии ДНК типовых культур дрожжей Saccharomyces. Звездочкой обозначены данные по ДНК-ДНК реассоциации из работы Vaughan Martini (1989). Остальные значения ДНК-ДНК рессоциации получены нами.


Метод ДНК-ДНК реассоциации позволяет устанавливать достаточно протяженные районы генетической гомологии между молекулами ДНК различных организмов (Jahnke, 1987). С помощью этого метода мы изучили родство дрожжей S. cariocanus, S. kudriavzevii и S. mikatae между собой и с типовыми культурами S. cerevisiae, S. bayanus, и S. paradoxusПолученные нами значения ДНК-ДНК реассоциации представлены на рисунке 1. Уровень ДНК-реаасоциации штаммов одного вида был высоким: 88–100%, а в межвидовых комбинациях низким: от 23 до 50%. Исключением является 98%-ная ДНК-ДНК реассоциация между S. cariocanus и S. paradoxus.

Согласно проведенному нами филогенетическому анализу, дрожжи ^ S. cariocanus не отличаются по последовательностям ITS1 и D1/D2 участков рРНК и митохондриального гена ATP9 от штаммов североамериканской популяции S. paradoxus. В то же время у S. cariocanus имеется (рис. 2) уникальная нуклеотидная замена в более консервативном гене 18S рРНК (позиция 191, согласно нумерации последовательности этого гена дрожжей S. cerevisiae). Следует отметить, что штаммы S. paradoxus разного географического происхождения не отличаются по последовательностям этого гена друг от друга и от дрожжей S. cerevisiae. Виды S. kudriavzevii и S. mikatae также имеют идентичные последовательности гена 18S рРНК, а S. arboricolus отличается от остальных видов 2–4 нуклеотидными заменами (рис. 2).

Несмотря на одинаковые базовые кариотипические характеристики (гаплоидное число хромосом равное 16 и одинаковый диапазон размеров хромосомных полос от 250 до 2200 т.п.н.), биологические виды Saccharomyces значительно отличаются на молекулярном и хромосомном уровнях (Fischer et al., 2000; Naumov et al., 2000).




Дрожжи ^ S. bayanus, S. cariocanus и S. mikatae имеют видоспецифичные молекулярные кариотипы, тогда как остальные биологические виды не отличаются по кариотипическим паттернам от S. cerevisiae. Уникальный кариотипический профиль дрожжей S. cariocanus связан с наличием четырех реципрокных транслокаций между хромосомами IX/XV, II/XVI, XI/IV и XII/XIV (Fischer et al., 2000). Мы сравнили молекулярные кариотипы S. cariocanus с кариотипами штаммов S. paradoxus из европейской, дальневосточной и североамериканской популяций (рис. 3). Обнаружено, что штаммы S. paradoxus из различных регионов имеют практически идентичные кариотипы (рис. 3, дорожки 12, 13, 15–25). Сходные кариотипические профили имеют дрожжи S. cerevisiae, S. arboricolus и S. kudriavzevii (рис. 3, дорожки 1–3, 6 и 7). Штаммы S. cariocanus отличаются по молекулярным кариотипам от всех остальных дрожжей Saccharomyces, включая географические популяции S. paradoxus (рис. 3, дорожки 10 и 11).

Несмотря на 98%-ную ДНК-ДНК-реассоциацию ^ S. cariocanus образует стерильные гибриды со штаммами S. paradoxus различного географического происхождения, включая североамериканские изоляты (Naumov et al., 2000). Стерильность межвидовых гибридов с участием S. cariocanus нельзя объяснить только наличием в его кариотипе реципрокных транслокаций, затрагивающих 8 из 16 хромосом. Принимая во внимание 50%-ную максимальную гибель гибридных аскоспор при наличии у одного из родительских штаммов одной реципрокной транслокации (Loidl et al., 1998), теоретически ожидаемая выживаемость аскоспор гибридов S. cariocanus × S. paradoxus, отличающихся четырьмя реципрокными транслокациями, должна составлять около 6.25% (100/24). В то же время в скрещиваниях с участием дрожжей S. cariocanus жизнеспособность гибридных аскоспор составляла 0-1% (Naumov et al., 2000; Fischer et al., 2000). Такая же жизнеспособность аскоспор отмечена в межвидовых скрещиваниях S. cerevisiae × S. paradoxus, имеющих 50%-ную ДНК-ДНК-реассоциацию (Naumov et al., 1993, 1996, 1998).




Рисунок 3. Молекулярные кариотипы дрожжей Saccharomyces

Дорожки: S. cerevisiae: 1, 14 – YNN 295 (хромосомный стандарт); 2 – ВКМ Y-502; S. arboricolus: 3 – 2.3317; S. bayanus var. bayanus : 4 – CBS 380 (Т); S. bayanus var. uvarum: 5 – MCYC 623; S. kudriavzevii: 6 - NBRC 1802 (Т); 7 – NBRC 1803; S. mikatae: 8 - NBRC 1815 (Т); 9 - NBRC 1816; S. cariocanus: 10 – UFRJ 50791; 11 – UFRJ 50816 (Т); S. paradoxus: (Европа) 12, 16 – CBS 432; 13, 15 – CBS 5829; 17 – CECT 10308; 18 – N7; 19 – N11; (Северная Америка) 20 - UCD-FST 52-153; 21 - UCD-FST 61-359; 22 – 95-1; (Дальний Восток) 23 – N 42; 24 – N 44; 25 – NBRC 1805. Т – типовая культура.


Для изучения влияния хромосомных перестроек на репродуктивную изоляцию дрожжей Saccharomyces, мы скрестили штаммы S. paradoxus европейского происхождения со штаммами из дальневосточной и североамериканской популяций. Проведенный нами гибридологический анализ и литературные данные указывают на то, что крупные хромосомные перестройки не играют определяющей роли в репродуктивной изоляции дрожжей Saccharomyces. Так, в наших опытах гибрид между европейским (N15) и дальневосточным (N42) штаммами, не имеющими крупных хромосомных перестроек, характеризовался 40%-ной выживаемостью аскосор. Жизнеспособность аскоспор гибрида между дальневосточным (N43) и европейским (CBS 5829) штаммами, имеющими хромосомные перестройки, была даже несколько выше – 45% (Naumov et al., 1993). По-видимому, на фертильность как внутри- так и межвидовых гибридов более существенное влияние оказывает конкретная комбинация скрещиваемых штаммов.

Таким образом, с генетической точки зрения дрожжи ^ S. cariocanus являются самостоятельным биологическим видом рода Saccharomyces. В то же время сходство по многим молекулярным маркерам дрожжей S. cariocanus и S. paradoxus указывает на их недавнюю дивергенцию.


^ 2. Внутривидовой полиморфизм дрожжей S. paradoxus и S. bayanus

Для изучения роли географических и гибридизационных факторов в эволюции дрожжей Saccharomyces мы провели анализ природного внутривидового полиморфизма дрожжей S. paradoxus и S. bayanus. Видовую идентификацию штаммов проводили с помощью ПДРФ-анализа некодирующих участков рДНК: 5.8S-ITS-фрагмента и межгенного спейсера IGS2, соответственно эндонуклеазами HaeIII/HpaII и AluI/BanI.

Внутривидовой полиморфизм изучали с помощью ПЦР с микросателлитным праймером (GTG)5, имеющим множественную локализацию в геноме дрожжей Saccharomyces. С помощью этого молекулярного маркера можно дифференцировать дрожжи S. cerevisiae, S. bayanus и S. paradoxus, а также идентифицировать отдельные штаммы указанных видов. Совместно с кафедрой биологии почв Почвенного факультета МГУ мы провели изучение дрожжей S. paradoxus, выделенных из филосферы различных видов растений в Московской области. Впервые выявлено доминирование этих дрожжей в природных субстратах с низким содержанием сахаров.

Мы сравнили (GTG)5-паттерны дрожжей Подмосковной популяции (MGU) и 6 штаммов ^ S. paradoxus (CBS 432, CECT 10178, N8, 9, 12 и 17), выделенных в разных регионах Европы и отличающихся по ПЦР-профилям. На основании сходства паттернов с микросателлитным праймером (GTG)5 была построена дендрограмма, представленная на рисунке 4.





Рисунок 4. Дендрограмма родства штаммов S. paradoxus, основанная на матрице различий по ПЦР-профилям с микросателлитным праймером (GTG)5. В качестве внешней группы использован штамм S. cerevisiae ВКМ Y-502. Приводятся значения бутстрепов > 50%.



Штаммы ^ S. paradoxus, изолированные в разных регионах Европы, в целом, более гетерогенны по ПЦР-профилям. Филогенетический анализ свидетельствуют о генетической однородности Подмосковной популяции дрожжей S. paradoxus.





Рисунок 5. Дендрограмма родства штаммов Saccharomyces bayanus, основанная на матрице различий по ПЦР-профилям с микросателлитным праймером (GTG)5. В качестве внешней группы использован штамм S. cerevisiae ВКМ Y-502. Данные обработаны по программе Simple Matching из компьютерного пакета TREECON. Приводятся значения бутстрепов >50%.

На материале штаммов различного экологического и географического происхождения нами изучен внутривидовой полиморфизм дрожжей S. bayanus. На основании сходства (GTG)5-профилей была построена дендрограмма, представленная на рисунке 5.

Обнаружена корреляция между микросателлитными маркерами штаммов и их происхождением. Штаммы, выделенные из природных источников и ферментационных процессов, отличались по ПЦР-профилям. На дендрограмме, построенной на основании сходства (GTG)5-паттернов, винные штаммы сгруппированы в зависимости от источника и места выделения: типа вина и конкретного винодельческого региона.


^ Двунитевая РНК (дн-РНК) биологических видов Saccharomyces. Одной из форм проявления конкурентных отношений дрожжей-сахаромицетов является способность убивать чувствительные клетки под влиянием видоспецифичных токсинов. Этот феномен широко распространен среди культурных, в основном, винных штаммов S. cerevisiae (Наумов и др., 1973; Schmitt, Breinig, 2002). Штаммы-убийцы содержат два типа вирусных плазмидных днРНК – M и L. Первая отвечает за синтез токсина и устойчивость к нему, вторая – за образование белковых капсул, в которых находятся отдельно M- и L-фракции днРНК. Мы изучили распространение и особенности плазмидных днРНК у разных видов Saccharomyces (рис. 6).





Рисунок 6. Плазмидные днРНК дрожжей Saccharomyces.

^ S. cerevisiae: 1 – М 437 (М2), 3 – K7 (M1); S. bayanus: 8 – IFI373 (M3), 15 - Sµ1 (M8), 16 – DDI4.95 (M10), 17 – SCU397 (M11); S. kudriavzevii: 4 – NBRC 10990 (M1), 9 – NBRC 10991 (M4); S. mikatae: 2 – NBRC 11001 (M2), 5 – NBRC 10999 (M3), 6 – NBRC 10995 (M3), 10 – NBRC 10993 (M4); S. paradoxus: 7 – №22 (M3), 11 – №16 (M4), 12 – №15 (M5), 13 – ВКМ Y-2472 (M6), 14 – DBVPG 1373 (M7); М – маркер молекулярных масс (т. п. н.) “1 kb DNA Ladder” (“Fermentas”, Литва). В скобках приведен тип М-днРНК.


Плазмидные днРНК отсутствуют только у ^ S. cariocanus. У S. kudriavzevii обнаружено два типа М-днРНК: М1 и М4, тогда как дрожжи S. mikatae характеризуются тремя типами плазмид: М2–М4. У дрожжей S. paradoxus и S. bayanus наряду со стандартной L-фракцией выявлено по 7 различных М-днРНК, соответственно М1–М7 и М1–М3, М8–М11 (рис. 6, дорожки 7, 11, 13-15). Таким образом, у дрожжей Saccharomyces всего идентифицировано 11 различных М-днРНК. Несмотря на то, что ряд штаммов S. paradoxus различного географического происхождения вообще не имеют днРНК (например, Подмосковная популяция) или имеют только L фракцию, большинство штаммов этого вида обладают L- и M-днРНК. По крайней мере, некоторые из M-фракций, например, M6, определяют синтез токсинов (Наумов, 1985). Как правило, штаммы S. bayanus не имеют днРНК. М-фракция обнаружена только у 11 из 68 изученных нами штаммов. Фенотипический анализ показал, что все обнаруженные плазмидные М-днРНК не функциональны и, возможно, являются мутантными формами киллерных плазмид.


^ 3. Дифференциация гибридных штаммов Saccharomyces

С целью обнаружения естественных межвидовых гибридов мы провели молекулярно-генетическое изучение 55 штаммов Saccharomyces из различных дрожжевых коллекций. С помощью ПДРФ-анализа некодирующих участков рДНК (5.8S-ITS-фрагмента и межгенного спейсера IGS2), молекулярного кариотипирования и множественной ПЦР удалось не только дифференцировать дрожжи S. cerevisiae, S. bayanus и S. kudriavzevii, но и обнаружить три межвидовых гибрида S. cerevisiae × S. kudriavzevii UCD 40-9, NRRL Y-53 и NRRL Y-1912. Молекулярный кариотип указанных гибридных штаммов приведен на рисунке 7. Штаммы NRRL Y-53 и NRRL Y-1912 имеют в своем кариотипе более 16 хромосомных полос, тогда как кариотип штамма UCD 40-9 менее сложный (рис. 7, дорожки 7–9). Следует отметить, что указанные три штамма выделены в США, тогда как все ранее описанные гибриды S. cerevisiae × S. kudriavzevii имеют европейское происхождение.





Рисунок 7. Пульс-электрофорез хромосомных ДНК.

Дорожки: 1 – YNN 295 (хромосомный стандарт); 2 – ВКМ Y-502 (^ S. cerevisiae); 3 – CBS 432 (S. paradoxus); 4 – MCYC 623 (S. bayanus); 5 – S6U (S. cerevisiae × S. bayanus); 6 – CID1 (S. cerevisiae × S. bayanus ×S. kudriavzevii); 7 – NRRL Y -53; 8 – NRRL Y-1912; 9 – UCD 40-9; 10 – NBRC 1802 (S. kudriavzevii); 11 – NBRC 1803 (S. kudriavzevii); 12 – NBRC 1815 (S. mikatae); 13 – UFRJ 50816 (S. cariocanus).



^ 4. Межвидовые гибриды S. cerevisiae × S. kudriavzevii

Для изучения геномной композиции штаммов UCD 40-9, NRRL Y-53 и NRRL Y-1912 использовали следующие молекулярные методы: 1) ПДРФ-анализ нескольких ядерных и митохондриальных генов и их секвенирование; 2) Саузерн-гибридизацию с зондами S. cerevisiae и S. kudriavzevii; 3) сравнительную геномную гибридизацию на микрочипах. С помощью cравнительного ПДРФ-анализа контрольных и гибридных штаммов по 13 ядерным генам нам удалось определить генотипы изучаемых штаммов (Таблица 1). Согласно секвенированию митохондриального гена ATP9 штаммы NRRL Y-53 и NRRL Y-1912 имеют мтДНК S. kudriavzevii, тогда как UCD 40-9 содержит мтДНК S. cerevisiae. Молекулярный анализ свидетельствует о более сложной геномной композиции гибридов NRRL Y-53 и NRRL Y-1912 по сравнению со штаммом UCD 40-9. Для сравнительной геномной гибридизации на микрочипах мы выбрали первые два штамма, имеющие различное происхождение: NRRL Y-53 выделен из пчелы, а NRRL Y-1912 – из вина.

^ Сравнительная геномная гибридизация штаммов NRRL Y-53, NRRL Y-1912 и их сегрегантов. Контрольный и анализируемый образцы, меченные различными флуоресцентными красителями, смешивали и конкурентно гибридизировали к микрочипам S. cerevisiae, на которые нанесены все полноразмерные ОРС штамма S288c. Полученные после гибридизации соотношения интенсивности флуоресцентных сигналов Cy3/Cy5 контрольного и гибридного штаммов нормализировали и визуализировали в программе RMA Express и CGH-Miner, соответственно. Гибридизационные соотношения для каждого гена картируются соответственно хромосомной локализации этого гена у контрольного штамма S288c. Участки повышенной копийности, по сравнению с S288c, на диаграмме обозначены красным цветом и расположены выше оси, а низкокопийные участки окрашены зеленым цветом и расположены ниже оси. В первом случае такой хромосомный район или отдельный ген называют амплифицированным, а во втором, учитывая гибридную природу изучаемых штаммов, корректнее обозначать такой участок как дивергировавший вместо делетированного. Высота каждого красного или зеленого столбика пропорциональна двоичному логарифму (log2) соотношения интенсивности сигналов Cy3/Cy5 для каждого гена. Резкие изменения гибридизационных сигналов, так называемые «скачки» (от английского «jumps») отражают присутствие химерных рекомбинантных хромосом, образовавшихся в результате нереципрокной рекомбинации гомеологичных хромосом.

С помощью программы CGH-Miner для каждого штамма и его сегрегантов были получены совмещенные кариоскопические диаграммы (от английского consensus plot), представленые на рисунке 8. Согласно CGH-профилям определены общие и специфические районы хромосом, которые подвергались изменениям у штаммов NRRL Y-53 и NRRL Y-1912.

Таблица 1. Генотипы межвидовых гибридов Saccharomyces и штаммов S. kudriavzevii

^ Хромо

cома

Ген

Гибрид

S6U*

Гибрид

CID1*

Гибриды S.cerevisiae  S. kudriavzevii

S. kudriavzevii

UCD 40-9

NRRL Y-53

NRRL Y-1912

W27

441

1802

1803

ZP542

I

CYC3

нд

нд

C1

C1K1

C1K1

C1K2

C1

K1

K2

К1

II

APM3

нд

нд

C1

C1K2

C1K3

C1K1

C1K1

K1

K3

K3

III

KIN82

нд

нд

C1

C1K1

C1K1

C1K1

C1K1

K1

K1

К1

III

MRC1

нд

нд

C1

C1K1

C1K1

C1K1

C1K1

K1

K1

К1

V

MET6

C1B1

C1B1K2

C1K1

C1K1

C1K1

C2K2

C2K2

K1

K1

K2

VI

ACTI

C1B1

C1B1K1

C1

C1K1

C1K1

нд

нд

K1

K2

К1

VI

GSY1

C1B1

C1B1K1

C1K1

C1K1

C1K1

C1K1

C1K1

K1

K1

К1

X

CYR1

C1B1

C1B1K2

C1K2

C1K2

C1K2

C1K2

C1K2

K1

K2

K2

X

PEX2

нд

нд

C1K1

C1K1

C1K1

C1K1

C1K1

K1

K1

К1

XI

BAS1

C1B1

C1B1K2

C1

C1K2

C1K2

C1K2

C1K2

K1

K2

К2

XI

CBT1

нд

нд

C1K2

K2

C1K2

C1K2

C1K2

K1

K2

К2

XIII

CAT8

C1B1

C1B1K1

C1

C1K1

C1K1

C1K1

C1K1

K1

K2

К1

XIV

MET2

C1B1

C1B1

C1

C1C2

C1C2

нд

нд

K1

K1

К1

8207586395635415.html
8207679226697133.html
8207785802887165.html
8207838075539016.html
8207973902588724.html